Полимеразная цепная реакция, также известная как ПЦР, является сложной диагностической технологией, способной обнаруживать инфекционные и вирусные заболевания. Подробнее о том, чем является ПЦР-диагностика, какими преимуществами она обладает и какие этапы проведения ее включает, мы расскажем в этой статье.

В частности, ПЦР-диагностика основывается на увеличении количества конкретной ДНК-части в образце, что позволяет ее определить в микроскопических количествах. Это обеспечивает высокую точность диагностики даже в случае незначительной концентрации заболевания.

Одним из главных преимуществ ПЦР-метода является его высокая чувствительность и специфичность, которые существенно повышают точность результатов тестов. Кроме того, ПЦР-диагностика может быть использована для обнаружения нескольких заболеваний одновременно, что экономит время и средства.

Этапы проведения ПЦР-диагностики включают подготовку образцов, извлечение и очистку ДНК, смешивание ДНК с реактивами, увеличение количества ДНК в циклах и анализ полученных результатов.

Таким образом, ПЦР-диагностика является перспективной и эффективной технологией, которая значительно облегчает задачу постановки диагнозов инфекционных и вирусных заболеваний. Ее преимущества и этапы проведения делают ее достойной конкурентом традиционных методов диагностики.

ПЦР-диагностика: принцип работы и возможности

Существующий чуть более 30 лет, метод диагностики инфекций с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) эволюционировал значительно и стал одним из наиболее точных и широко используемых способов выявления патогенных микроорганизмов.

Основой ПЦР является многократное увеличение концентрации фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. Этот процесс делает возможным копирование участка ДНК, который существует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

За несколько минут и несколько десятков циклов амплификации можно получить количество молекул, достаточное для дальнейшего анализа. Кроме того, с помощью ПЦР можно проводить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это делает ПЦР полезным не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Проведение ПЦР-диагностики требует специального оборудования и производится в специальных лабораториях. На сегодняшний день существует множество различных модификаций метода, включая технологии с использованием кислоты РНК. В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре и для их проведения не требуется специальное оборудование.

Популярным среди различных модификаций является "горячий старт ПЦР", который предварительно прогревает пробирки с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут для предотвращения клонирования неспецифических фрагментов ДНК.

Еще одной популярной модификацией является мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование нескольких фрагментов в одной пробирке. Это позволяет сократить время и затраты на проведение анализа и повысить точность исследования методом ПЦР.

ПЦР-диагностика - метод анализа, широко используемый в клинической медицине для выявления различных заболеваний. Данный метод имеет множество сфер применения, среди которых можно выделить следующие:

В урогинекологии

Метод помогает выявлять инфекционные заболевания, слабо проявляющие свои симптомы и имеющие хронический характер. ПЦР-диагностика позволяет определять наличие половых инфекций, таких как хламидиоз, микоплазма, уреаплазма, трихомониаз, гарднерелла, кандида, гонококк и трепонема. Кроме того, данный метод позволяет детектировать группу вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, включая вирус герпеса и вирус папилломы человека. Своевременное выявление и лечение данных инфекций способствует избежанию риска развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии

ПЦР-диагностика используется для выявления наличия неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. Данный метод является эффективным при выявлении опасных инфекций, таких как цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

В службе крови

Метод применяется для избежания риска переливания крови или плазмы, инфицированной опасными заболеваниями (ВИЧ, сифилис, гепатиты). ПЦР-диагностика значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку метод способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

В клинике инфекционных заболеваний

Метод помогает выявлять заболевания, такие как гепатит, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.

В фтизиатрии и пульмонологии

ПЦР-диагностика позволяет выявлять возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, данный метод позволяет не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, выявить конкретный штамм. Также метод ПЦР используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Другие сферы применения

Следует отметить, что ПЦР-диагностика имеет множество других сфер применения, таких как криминалистика, экспериментальная медицина, создание генетических паспортов, мониторинг состояния окружающей среды, анализ продуктов питания, фармакология и ветеринария.

Оценить наличие возбудителя инфекции в организме иногда не так просто. Именно поэтому ПЦР-диагностика получила такое широкое распространение в медицинской практике. Она является более точным и надежным методом, чем многие другие аналитические способы, и имеет ряд явных преимуществ:

С помощью ПЦР-метода можно непосредственно определить наличие возбудителя инфекции. К примеру, иммуноферментный анализ (ИФА) выделяет только белки-маркеры, которые являются побочным продуктом жизнедеятельности микроорганизмов, и поэтому указывает на наличие инфекции косвенно. С другой стороны, ПЦР-анализ выявляет специфические участки в ДНК и с большой точностью указывает на присутствие конкретной инфекции.

Высокая специфичность ПЦР-диагностики обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляются лишь фрагменты ДНК, которые характерны только для определенных возбудителей инфекции. Это исключает вероятность ложных результатов анализа, чего неизбежно можно заблюдать в иммунологических методах, где ошибки возникают из-за перекрестной реакции антигенов.

ПЦР-диагностика также отличается от многих других методов высокой чувствительностью. Она позволяет выявить наличие даже единичных клеток вирусов или бактерий в таких случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. Например, ПЦР позволяет выявлять всего 10-100 клеток в пробе, в то время как при использовании иммунологических и микроскопических тестов для определения инфекции необходимо иметь не менее 103-105 клеток.

Применение универсальных методов лабораторных исследований, которые диагностируют сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы, является еще одним плюсом ПЦР-диагностики. Этот метод может применяться для выявления возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания и других материалах.

Скорость получения результатов является еще одним преимуществом ПЦР-диагностики. Поскольку для проведения анализа не нужно производить посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени не требуется. Весь цикл от забора биоматериала до получения результатов занимает всего 4-5 часов.

В заключение, метод ПЦР-диагностики известен своей способностью диагностировать трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, которые могут вызывать скрытые инфекции.

Ограничения ПЦР-диагностики

Не смотря на то, что ПЦР-диагностика является одним из самых эффективных и популярных методов диагностики, у неё есть свои ограничения. Однако, это ограничения настолько незначительны, что не могут негативно сказаться на эффективности метода.

Ограничения метода включают следующее:

• Вероятность амплификации ДНК не только живых, но и погибших микроорганизмов.
• Возможность возникновения перекрестной реакции.
• Изменчивость микроорганизмов.

Для контроля эффективности лечения при проведении ПЦР-диагностики необходимо соблюдать определенные требования. Например, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1-2 месяца), за который происходит полное исчезновения возбудителя инфекции в организме.

Теоретически, перекрестная реакция может возникнуть, если фрагменты ДНК праймеров будут совпадать с фрагментами ДНК, присутствующими в других микроорганизмах, чей геном на данный момент еще не расшифрован.

За счёт изменчивости микроорганизмов некоторые его штаммы могут стать неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики разрабатывались для того, чтобы уменьшить риски ложноположительных результатов анализа, и включающие проверку на перекрестные реакции, а также тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР имеет несколько этапов, которые проводятся в специальной лаборатории.

Первым этапом является забор биоматериала. Эта процедура проводится с помощью стерильного оборудования и только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть различные эпителиальные соскобы, моча, мокрота, кровь, сыворотка, плазма, биологические жидкости, а также биоптаты. Запрещено попадание следов крови в материал.

Следующий этап - хранение и транспортировка биоматериала. Образцы можно хранить на комнатной температуре в течение не более 2 часов или в холодильнике на температуре 2-8°С не более 1 суток. Некоторые биоматериалы допускают замораживание на срок до 2 недель, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Если требуется транспортировка, то пробы следует помещать в специальные термоконтейнеры или термосы.

Далее производится выделение ДНК из образца методом твердофазной сорбции. Затем в микроцентрифугу добавляется амплификационная смесь, после чего пробы устанавливаются в программируемый термостат и проводится амплификация. Время проведения зависит от заданной программы и составляет 2-3 часа.

После амплификации проводится регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяется методом электрофореза и образуется светящаяся полоса при облучении ультрафиолетовым излучением. Наличие светящейся полосы в ультрафиолетовом свете свидетельствует о положительном результате.

Интерпретация результатов исследования позволяет сделать выводы о наличии или отсутствии инфекции в организме человека. Количественный результат ПЦР-анализа может помочь врачу определить степень активности заболевания и выбрать соответствующее лечение.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод диагностики инфекций с различным уровнем ценовой политики в разных клиниках. Стоимость ПЦР-анализа зависит от условий процедуры, включая целевые инфекции, виды анализируемого материала, а также методы тестирования – качественные или количественные. Обычно на определение одной инфекции расходуют от 200 до 800 рублей. Ключевым фактором является также оплата за сбор материала – до 400 рублей. В таблице 1 указана средняя стоимость ПЦР-диагностики различных видов.

Многие медицинские центры предлагают комплексное проведение ПЦР-исследования, в рамках которого сразу происходит несколько анализов. Например, «ПЦР-8» (восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) – 1400 рублей или «ПЦР-12» (двенадцать половых инфекций) – 3500 рублей. Такая услуга существенно экономит деньги, поскольку отдельный ПЦР-анализ на каждую инфекцию обойдется гораздо дороже.

Фото: freepik.com